乙肝病毒核心区基因变异与细胞免疫

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李嘉  朱理珉  梁树人  李顺天  徐健
【摘要】  目的  探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）核心区Leu60Val变异与机体细胞免疫水平的关系。 方法  通过流式细胞分析技术（FCM）检测外周血T淋巴细胞亚群，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清细胞因子［干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）]水平，采用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA C基因区片段，并对PCR产物直接测序。 结果  91例慢性乙型肝炎患者发生Leu60Val变异者19例，变异率为20.9%，随病情加重变异率逐渐增加，以重型肝炎组最高；Val60变异株组IFN-γ、TNF-α水平明显增高（t值分别为2.584、4.766，P<0.01），CD4+ /CD8+比值逐渐升高（t＝2.275，P<0.05）。 结论  Val60变异株可能通过增加与Ⅰ类人白细胞抗原（HLA-I）的亲和力，或上调HLA-I类分子的表达，从而激活大量的细胞毒性T淋巴细胞释放细胞因子，并同时在肝脏局部发挥免疫效应，提高对宿主的杀伤力。
【关键词】  肝炎病毒，乙型； 变异； 细胞因子； T淋巴细胞亚群； 序列

Relationship between the HBV core gene mutation and the cellular immunity in host  LI Jia, ZHU Li-min, LIANG Shu-ren, LI Shun-tian, XU Jian. Tianjin Infectious Diseases Hospital, Tianjin 300192, China
【Abstract】    Objective    To study the relationship between the mutation of Leu60Val in HBV core region and the cellular immunity in patients with chronic hepatitis B (CHB). Methods    HBV DNA C gene mutation was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing the products directly. The cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-2) levels in serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The distribution of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood was detected by flow cytometry (FCM). Results    The mutation of Leu60Val was found in 19 out of the 91 CHB patients. With the CHB severity, the mutation rate was getting higher, especially in the severe hepatitis group. The IFN-γ and TNF-α levels were much higher in mutant strain group than those in wild strain group (t = 2.584, 4.766, P < 0.01), so was the ratio of CD4+/CD8+ (t = 2.275, P < 0.05). Conclusion    The mutant strain of 60Val may increase affinity to HLA-I molecule, or up-regulate the expression of HLA-I molecule, resulting in the activation of CTL to release the cytokines and cause immune response in liver.
【Key words】    Hepatitis B virus;  Mutation;  Cytokines;  T-lymphocyte subpopulations;  Sequence
慢性乙型肝炎患者的肝细胞损伤主要是由于机体针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）发生的免疫反应所引起，其中作为效应细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是肝细胞发生病理损害的主要介导者，而针对HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）的CTL应答是决定病毒是否被清除的关键。当HBV基因发生变异，可以改变氨基酸分子的表达，尤其当CTL识别的重要表位发生变异会改变机体针对病毒的免疫反应。本实验通过对HBV DNA C基因区进行核苷酸序列分析，并同时检测患者外周血T细胞亚群（CD4+、CD8+）及血清细胞因子水平［γ干扰素（interferon γ，INF-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）及白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）］，从而了解HBV核心区第60位亮氨酸变异为缬氨酸（Leu60Val）的情况及机体的免疫状况，探讨在慢性乙型肝炎中，HBV核心区Val60变异株与机体细胞免疫水平的关系。
资料与方法
1．病例选择：病例为天津传染病医院1999年10月～2001年10月收治的91例慢性乙型肝炎患者，其中轻度21例，年龄（34.95±11.38）岁；中度24例，（36.05±13.45）岁；重度23例，（35.45±10.47）岁；重型肝炎23例，（39.71±12.20）岁。血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒血清学标志检测均阴性。诊断符合符合2000年西安修订的病毒性肝炎诊断标准。
2．HBV DNA C基因区扩增及序列分析：根据GeneBank公布的31条HBV全基因序列，选取C基因区两端保守区域，设计合成2条特异性引物（C1和C2）进行PCR扩增，并经Pcrdesn软件进行检验，测序引物为C3。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物C1 5′-TGGAGACCACCGTGAACGCC-3′（nt 1609～1628），C2 5′-AAAGACAGGTACAG TAGAAG-3′（nt 2516～2497），C3 5′-GGCGAG GGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′（nt 2364～2388）。dNTP为美国Gibco公司产品，Taq DNA聚合酶、Tris饱和酚购于北京鼎国生物技术发展中心，DNA测序试剂盒为加拿大Visible Genetic公司的末端标记试剂盒及OpenGene 自动DNA测序仪和Version 3.0进行DNA测序电泳及序列分析。提取血清DNA，采用PCR扩增HBV DNA C区基因，电泳后在紫外光下检测PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳回收法回收产物，并进行产物的纯化，采用双脱氧链末端终止法进行测序反应，对测序产物纯化后进行测序电泳。
3．血清细胞因子检测：IFN-γ、TNF-α和IL-2试剂盒购自美国Gibco公司。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测，一抗为生物化学抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的streptavidin，用标准品绘制曲线并计算429nm吸光度时标本浓度。
4．外周血T细胞亚群的检测：采用流式细胞术，选用三色荧光标记的免洗试剂（TriTESTTM CD4 FITC+CD8PE+CD3PerCP）直接荧光染色。荧光标记试剂、红细胞裂解液及同型对照均为美国BD公司的产品。取抗凝血1ml，先将白细胞数调至（4.0～10）×109/L，在管底部加入CD3/CD4/CD8三色直标荧光抗体20μl和混匀的肝素抗凝血100μl，彻底混匀后室温避光30min。加１×红细胞裂解液1ml于试管内充分混匀，室温避光保存15min，上机检测。
5. 统计学处理：各组间率的比较用χ2检验，各组间均数比较用t检验，方差分析用F检验。
结    果
1. HBV核心区第60位氨基酸（aa60）变异情况：参照我国HBV流行株（C基因型）标准序列，进行核酸序列对齐比较。91例慢性乙型肝炎患者中19例（20.9%）发生aa60变异，为亮氨酸Leu被缬氨酸Val替代（即第2078位核苷酸C被G替代）。其中慢性轻度3例（14.3%)，中度4例(16.7%)，重度5例(21.7%)，重型7例(30.4%)。提示随病情加重aa60变异率增加，以重型肝炎组最高。

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